Секвенирование по Сэнгеру (ферментативный метод)

Секвенирование по Сэнгеру (ферментативный метод) * секвеніраванне па Сэнгеру (ферментатыўны метад) * Sanger sequencing (enzymatic method) — техника секвенирования (см.) однонитчатой ДНК. В основе метода — присоединение (отжиг, см.) к однонитчатой ДНК-мишени секвенирующего праймера (Праймер) или обратного секвенирующего праймера (обычно синтетических олигонуклеотидов). Реакционная смесь переносится в 4 пробирки, куда добавляются все 4 дезоксинуклеозидтрифосфата, один из которых мечен по 32P. Каждая пробирка содержит разные дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ддАТФ, ддСТФ, ддГТФ и ддТТФ). Для синтеза комплементарной копии к однонитчатой последовательности-мишени в пробирки добавляется фрагмент Кленова (Кленова фрагмент). В результате происходит удлинение праймера в соответствии с матричной последовательностью. Когда в растущую цепь вместо соответствующего дНТФ в матрице включается ддМТФ, 31конец растущей цепи теряет гидроксильную группу и не может дальше удлиняться: цепь терминируется. В итоге каждая реакционная смесь получит популяцию радиоактивно меченых фрагментов ДНК с общим 51-концом (праймер), но разными 31концами. После окончания реакции ДНК денатурируется, подвергается электрофорезу в тонкослойном полиакриламидном геле (Секвенирующий гель) и с помощью радиоавтографии (см.) выявляются радиоактивные полосы. Последовательность нуклеотидов в исходной ДНК-мишени может затем прочитываться прямо с радиоавтограммы.